细胞外 pH 值及其波动对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞凋亡的作用及机制研究

摘要：目的：探讨细胞外 pH 值的变化及其波动对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）凋亡的作用及机制。方法2014年11月—2015年3月，选取8～10周龄健康雄性 SD 大鼠6只。采用简单随机抽样法选取2只大鼠，体外分离培养大鼠胸主动脉 VSMCs。采用随机数字表法将 VSMCs 分为 pH 7.4组和高磷组，高磷组又分为pH 6.8＋磷组、pH 7.4＋磷组、pH 7.7＋磷组和 pH 6.8/7.7＋磷组。pH 7.4组采用含10％胎牛血清（FBS）的 DMEM培养基培养。高磷组采用高磷培养基（10 mmol/ L β-甘油磷酸）培养，并根据数字酸度计的读取值酌情加入1 mol/ L HCl 或7.4％ NaHCO3调整 pH 值；pH 6.8/7.7＋磷组第1天给予 pH 7.7刺激、第2天给予 pH 6.8刺激。将剩余4只大鼠按照上述方法培养，重复2次。采用免疫组织化学（SP 法）进行细胞鉴定。采用反转录聚合酶链反应（RT - PCR）法检测半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（ Caspase -3） mRNA 相对表达水平及 B 淋巴细胞瘤2（ Bcl -2） mRNA/ Bcl -2相关 X 蛋白（Bax）mRNA。采流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果倒置相差显微镜下可见：大鼠胸主动脉组织块贴壁3～4 d 后细胞从组织块边缘爬出，细胞为长梭形，呈束状排列；5～6 d 成同心圆状细胞团，形成明显的细胞生长晕，并围绕组织块边缘呈束状、放射状延伸；6～7 d 后细胞融合成片，细胞体梭形或不规则三角形，细胞质向外伸出2～3个长短不等的突起。免疫组织化学检测可见：细胞质表达强阳性。pH 6.8＋磷组Caspase -3 mRNA 表达水平低于pH 7.4组，pH 7.4＋磷组、pH 7.7＋磷组Caspase -3 mRNA 表达水平高于 pH 7.4组（P ＜0.05）；pH 7.4＋磷组、pH 7.7＋磷组、pH 6.8/7.7＋磷组 Caspase -3 mRNA 表达水平高于 pH 6.8＋磷组（ P ＜0.05）；pH 7.7＋磷组Caspase -3 mRNA 表达水平高于 pH 7.4＋磷组，pH 6.8/7.7＋磷组 Caspase -3 mRNA 表达水平低于pH 7.4＋磷组、pH 7.7＋磷组（P ＜0.05）。pH 7.4＋磷组、pH 7.7＋磷组、pH 6.8/7.7＋磷组 Bcl -2 mRNA/ Bax mRNA 分别小于 pH 7.4组、pH 6.8＋磷组（P ＜0.05）；pH 7.7＋磷组Bcl -2 mRNA/ Bax mRNA 小于pH 7.4＋磷组（ P ＜0.05）；pH 6.8/7.7＋磷组 Bcl -2 mRNA/ Bax mRNA 大于pH 7.7＋磷组。pH 6.8＋磷组、pH 7.4＋磷组、pH 7.7＋磷组、pH 6.8/7.7＋磷组细胞凋亡率大于 pH 7.4组（ P ＜0.05）；pH 7.4＋磷组、pH 7.7＋磷组、pH 6.8/7.7＋磷组细胞凋亡率大于pH 6.8＋磷组（P ＜0.05）；pH 7.7＋磷组细胞凋亡率大于 pH 7.4＋磷组，pH 6.8/7.7＋磷组细胞 凋 亡 率 小 于pH 7.4＋磷组（P ＜0.05）；pH 6.8/7.7＋磷组细胞凋亡率小于pH 7.7＋磷组（P ＜0.05）。结论细胞外酸性环境能够抑制高磷培养的大鼠 VSMCs 凋亡，而细胞外碱性环境能够促进其凋亡。其具体机制可能是影响了 Bcl -2、Bax 的表达水平进而影响了 Caspase -3的表达水平，从而影响了细胞凋亡。