重组人促红细胞生成素治疗肾间质纤维化的作用机制研究

摘要：目的：探讨重组人促红细胞生成素（rHuEPO）治疗肾间质纤维化（RIF）的作用机制。方法2014年7月—2015年6月，将人肾小管上皮细胞（ HK-2细胞）随机分为7组：空白对照组（ E1组）：未加任何刺激物；rHuEPO 对照组（ E2组）：rHuEPO 终浓度为20 U/ ml；人纯化清蛋白诱导组（ E3组）：人纯化清蛋白终浓度为5 mg/ ml；E4组：加人纯化清蛋白（5 mg/ ml）和 rHuEPO（5 U/ ml）；E5组：加人纯化清蛋白（5 mg/ ml）和 rHuEPO （10 U/ ml）；E6组：加人纯化清蛋白（5 mg/ ml）和 rHuEPO（20 U/ ml）；Rho 相关卷曲螺旋形成的蛋白激酶（ROCK）抑制剂 Y27632组（E7组）：加 ROCK 抑制剂 Y27632（10μmol/ L），30 min 后加人纯化清蛋白（5 mg/ ml）。采用细胞增殖试验检测刺激16、24、48、72 h 时各组细胞增殖数，反转录-聚合酶链式反应（ RT-PCR）法检测 RhoA、ROCK mRNA 表达水平，细胞免疫荧光法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E -钙黏蛋白（E - cadherin）表达水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测纤维连接蛋白（FN）表达水平。结果16 h 时，各组细胞增殖数比较，差异无统计学意义（P >0.05）。24、48、72 h 时，各组细胞增殖数比较，差异有统计学意义（P <0.05）；其中 E3~ E6组高于 E1组、E2组，E4~ E6组高于 E3组，E7组低于 E3组，E5组、E6组高于 E4组，E6组高于 E5组（ P <0.05）。各组RhoA mRNA 表达水平比较，差异有统计学意义（P <0.05）；其中 E3~ E6组高于 E1组、E2组，E4~ E6组低于 E3组，E5组、E6组低于 E4组，E6组低于 E5组（P <0.05）。各组 ROCK mRNA 表达水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其中 E3~ E6组高于 E1组、E2组，E4~ E7组低于 E3组，E5组、E6组低于 E4组，E6组低于 E5组（P <0.05）。各组α-SMA 表达水平比较，差异有统计学意义（P <0.05）；其中 E3~ E5组高于 E1组、E2组，E4~ E7组低于 E3组，E5组、E6组低于 E4组，E6组低于 E5组（P <0.05）。各组 E - cadherin 表达水平比较，差异有统计学意义（P <0.05）；其中 E3~ E6组低于 E1组、E2组，E4~ E7组高于 E3组，E5组、E6组高于 E4组，E6组高于 E5组（P<0.05）。各组 FN 表达水平比较，差异有统计学意义（P <0.05）；其中 E3~ E5组高于 E1组、E2组，E4~ E7组低于E3组，E5组、E6组低于 E4组，E6组低于 E5组（ P <0.05）。E3组、E4组、E5组、E6组 RhoA mRNA 与 ROCK mRNA 均呈正相关（P <0.05）。结论人纯化清蛋白能诱导 HK-2细胞发生上皮细胞-间充质细胞转分化（EMT），进而发生 RIF，而 rHuEPO 通过阻断 EMT 的 RhoA/ ROCK 信号转导通路从而抑制 RIF 发生，且在一定范围内 rHuEPO 水平越高，其抑制作用越强。